PENGENALAN ALAT DAN KESELAMATAN KERJA DI LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

AUTOKLAF

Fungsi : Untuk mensterilisasi peralatan dan media dengan pemanasan yang mampu
mematikan mikroba dan bakteri.

Prinsip Kerja : Pemanasan dengan uap air panas yang bertekanan tinggi, 

dimana tekanan yang umum digunakan untuk mensterilkan yaitu 1 atm dengan suhu 121 ⁰C selama 15 menit. 

HOTPLATE

Fungsi : Menghomogenkan suatu larutan melalui pemasan dengan pengadukan secara otomatis.

Prinsip Kerja : Menghomogenkan larutan dengan pemanasan dan di aduk secara otomatis dengan bantuan magnet hot plate.

DESIKATOR

Fungsi : Untuk menyerap uap air bebas yang ada di bahan atau sampel dan mempertahan-kan kadar air.

Prinsip Kerja : Slikagel akan  menyerap H₂O yang menguap dari bahan atau sampel tersebut.

INKUBATOR 

Fungsi : Untuk menginkubasi atau meremajakan mikroba pada suhu dan kelembapan yang stabil dan konstan.

Prinsip Kerja : Menggunakan suhu yang terkontrol dan aliran udara sebagai penghantar, serta menghomogenkan media tanpa adanya pengocokan.

 

MICROWAVE

Fungsi : Pemanasan dan untuk pencairan bahan - bahan yang sifatnya padat.

Prinsip kerja : Sterilisasi microwave dengan temperature (320-356 F) selama minimal  2 jam dengan bantuan gelombang mikro.

STERILISASI DAN PEMBAUATAN MEDIA

Sterilisasi

Sterilisasi merupakan proses membebaskan dan mematikan mikro-organisme dari suatu media pertumbuhan mikroba dan peralatan laboratorium. Sterilisasi dilakukan agar suatu media steril dan dapat digunakan sebagai mediaperkembangbiakan mikroba yang diinginkan tanpa terjadi kontaminasi dari berbagai jenis mikroorganisme.Pada dasarnya sterilisasi dapat dilakukan dengan tiga metode yaitu secara fisik dengan pemanasan, secara kimia dengan menggunakan desinfektan, dan secara mekanik dengan melakukan filtrasi.

Metode – metode Sterilisasi

            Sterilisasi dapat dilakukan dengan menggunakan metode secara fisik, kimia, dan mekanik. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan cara pemanasan, pembakaran, penggunaan radiasi, dan penggunaan gelombang ultrasonik. Secara kimia dilakukan dengan menggunakan desinfektan berupa alkohol, etil oksida, klor, dan formaldehid. Secara mekanik dengan melakukan filtrasi. Sterilisasi secara  Fisik menggunakan panas uap dan panas kering. Uap jenuh mempunyai aktivitas pembunuhan yang tinggi dan dapat membunuh semua jenis mikroorganisme, termasuk spora yang resisten dalam waktu 15 menit pada temperatur 121°C. Mekanisme pembunuhannya adalah perusakan mikroorganisme dengan mendenaturasi protein penting untuk pertumbuhan, reproduksi mikroorganisme, dan pelelehan membaran sel. Sterilisasi panas kering sering digunakan untuk bahan tahan panas, misalnya logam, gelas, minyak, dan lemak. Panas kering tidak hanya merusak mikroorganisme tetapi juga merusak pirogen. Temperatur yang digunakan adalah 160°C. Mekanisme pembunuhan mikroorganisme dengan panas kering adalah proses oksidasi. Sterilisasi secara mekanik dapat dilakukan dengan cara filtrasi dengan ukuran pori maksimum 400 nm dapat digunakan untuk memperoleh filtrat bebas bakteri.  Sterilisasi secara kimiawi dengan menggunakan senyawa kimia yang bersifat bakteriostatik  atau menghambat pertumbuhan bakteri dan bahkan bersifat bakterisida atau membunuh bakteri pada konsentrasi yang tinggi.

Autoclave

Autoclave adalah alat yang digunakan untuk mensterilkan peralatan laboratorium dan media pertumbuhan mikrobadengan menggunakan tekanan uap air dengan suhu 121⁰C 1 atm selama kurang lebih 15 menit, karena pada kondisi seperti itu tidak ada lagi mikroorganisme yang mampu mempertahankan hidupnya hingga akhirnya mikroba mati. Autoclave menggunakan prinsip pemanasan dengan uap air panas yang bertekanan tinggi agar bisa mematikan mikroorganisme dan melemahkan sel-sel sporanya.

Media Pertumbuhan Mikroba

            Media pertumbuhan mikroba adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi (nutrient) yang digunakan oleh suatu mikroorganisme untuk tumbuh dan berkembangbiak. Media yang baik untuk pertumbuhan mikroba harus mengandung komposisi meliputi air, Sumber energi metabolik, zat hara, asam amino, vitamin, nukleosida, memiliki pH, temperatur dan tekanan osmotik yang sesuai dengan   kebutuhan mikroorganisme, serta media tersebut harus steril, agar tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme pencemar. Mikroba memanfaatkan nutrisi pada media berupa molekul-molekul kecil yang dirangkai untuk menyusun komponen sel nya. Mikroba memerlukan suplai nutrisi sebagai sumber energi dan pertumbuhan selnya. Unsur-unsur dasar yang dibutuhkan mikroba meliputi karbon, nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, zat besi dan sejumlah kecil logam lainnya. Ketiadaan atau kekurangan sumber-sumber nutrisi ini dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba hingga pada akhirnya dapat menyebabkan kematian.

Media Sintetis

            Media sintetis, yaitu media yang disusun dari senyawa kimia yang jenis dan takarannya diketahui secara pasti. Media sintetis meliputi media PCA, media NA, dan media PDA.

Media Semisintetis

            Media semi sintetis merupakan media yang disusun dari bahan-bahan alami dan bahan-bahan sintetis. Media semisintetis meliputikentang agar, tauge agar dan kaldu nutrisi yang tersusu dari Pepton  10,0 g, Ekstrak daging 10,0 g, NaCl 5,0 g, dan Aquadest 1000 ml. 

INOKULASI MIKROBA

Inokulasi Mikroba

Inokulasi merupakan kegiatan memindahkan mikroorganisme baik berupa bakteri maupun jamur dari tempat lama atau sumber asalnya ke medium baru yang telah dibuat dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi dan aseptis. Sebelum melakukan penanaman bakteri  atau inokulasi terlebih dahulu semua alat dan bahan yang akan digunakan disterilkan untuk menghindari terjadinya kontaminasi.

Metode Inokulasi

Metode yang dilakukan pada proses inokulasi meliputi metode gores,  tuang, sebar, dan tusuk. Metode gores dilakukan dengan cara inokulum digoreskan pada permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah atau lup inokulasi. Metode gores  memerlukan keterampilan yang diperoleh dengan latihan, tapi tidak membutuhkan waktu yang lama. Metode sebar dimana inokulum disebarkan pada permukaan medium dengan menggunakan hockey stick untuk memperoleh penyebaran bakteri yang merata dengan baik. Metode tuang dilakukan dengan cara menuangkan inokulum dan media pada cawan petri secara bersamaan. Kelemahan metode ini adalah membutuhkan waktu dan  bahan yang lama dan banyak, akan tetapi tidak memerlukan keterampilan tinggi. Metode tusuk dilakukan dengan cara meneteskan atau menusukkan ujung jarum ose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam media.

Pengenceran Bertingkat

Pengenceran bertingkat yaitu proses pengenceran yang dilakukan untuk memperkecil atau mengurangi konsentrasi atau jumlah mikroba. Penentuan tentang banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Pada pengenceran bertingkat digunakan larutan dengan volume  1 ml dari pengenceran sebelumnya. Faktor pengenceran berpengaruh terhadap jumlah mikroba, dimana jika tingkat pengenceran tinggi maka mikroba yang ditumbuhkan semakin sedikit begitupun sebaliknya jika tingkat pengenceran kecil maka semakin banyak mikroba yang akan tumbuh.

Metode Spread Plate (Cawan Sebar)

Metode spread plate (cawan sebar) adalah suatu teknik dalam menumbuhkan mikroorganisme pada media agar dengan cara menuangkan suspensi mikroba dan meratakannya di atas media agar yang telah memadat menggunakan hockey stick. Pada metode ini, media agar dituangkan terlebih dahulu. Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian permukaan agar. Mikroorganisme yang baik ditumbuhkan pada metode ini adalah mikroorganisme aerob karena media agar dituang terlebih dahulu daripada kultur mikroba sehingga menyebabkan kondisi aerob pada cawan petri.

Metode Pour Plate (Cawan Tuang)

Metode pour plate (cawan tuang) adalah metode yang digunakan dalam menumbuhkan mikroba pada media agar yang dilakukan dengan cara menuang suspensi mikroba ke dalam cawan petri lalu kemudian tuang media agar ke dalam cawan petri. Media pada metode pour plate dituang sebanyak dua kali. Mikroorganise yang baik ditumbuhkan pada metode ini adalah mikroorganisme anaerob karena kultur mikroba dituang lebih dahulu  daripada media sehingga keadaan pada cawan petri menjadi anaerob.

PERHITUNGAN JUMLAH MIKROBA

PERHITUNGAN JUMLAH MIKROBA

       Mikroorganisme adalah organime yang hanya bisa dilihat dengan menggunakan mikroskop. Mikroorganisme juga disebut organisme mikroskopis. Mikroorganisme yang sangat kecil yang dapat dibudidayakan dalam cawan petri atau inkubator di laboratorium dan mampu mereproduksi dirinya sendiri melalui mitosis. Mikroorganisme merupakan makhluk hidup sangat kecil yang diklasifikasikan ke dalam kelas protista terdiri dari bakteri, jamur, protozoa dan algae.

Metode Total Plate Count (TPC)

          Beberapa metode dapat dilakukan untuk menghitung jumlah bakteri yang terdapat pada kultur mikroba. Metode yang paling sering digunakan adalah metode perhitungan koloni pada lempeng biakan (plate count). Selain itu juga dapat dilakukan perhitungan langsung secara mikroskopis. Prinsip dari metode hitungan cawan atau TPC (Total Plate Count) adalah menumbuhkan sel mikroorganisme yang masih hidup pada media agar, sehingga mikroorganisme akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode ini merupakan metode yang paling sensitif untuk menentukan jumlah mikroba. Begitupun halnya dengan praktikan yang dapat menghitung sel yang masih hidup, menentukan jenis mikroba yang tumbuh dalam media tersebut serta dapat mengisolasi dan mengidentifikasi jenis koloni mikroba tersebut.

RUMUS PERHITUNGAN JUMLAH MIKROBA METODE TPC

Faktor Pengenceran

        Faktor pengenceran merupakan salah satu hal yang perlu diperhatikan pada proses perhitungan mikroba. Pengenceran dilakukan untuk menghindari terjadinya penumpukan mikroba pada satu titik dan mengurangi kepadatan mikroba yang ditanam. Hal  ini berkaitan dengan kemampuan mikroba untuk tumbuh pada media dan memberi kemudahan pada saat perhitungan mikroba. Faktor pengenceran yang umum digunakan pada pengenceran bertingkat yaitu 10^-10, namun pada praktikum kali ini hanya digunakan faktor pengenceran 10^-4. Larutan yang digunakan pada pengenceran yaitu larutan NaCl yang merupakan larutan fisiologis dan kemudian dilarutkan kedalam aquades dengan perbandingan 1 : 9 ml. Proses pengenceran  diperlukan ketepatan dan ketelitian dalam pengambilan atau pemidahan larutan menggunakan pipet volum.

Faktor – faktor yang Mempengaruhi Metode Total Plate Count (TPC)

       Faktor yang mempengaruhi perhitungan mikroba metode TPC meliputi proses sterilisasi, proses inkubasi, faktor pengenceran, serta kesalahan praktikan saat menghitung jumlah koloni mikroba tersebut. Proses sterilisasi merupakan proses mematikan semua jenis mikroba yang tidak diinginkan untuk tumbuh, tetapi tidak menutup kemungkinan masih ada spora mikroba yang jika diberi nutrisi dan lingkungan yang sesuai maka spora tersebut akan tumbuh menjadi mikroba.  Faktor pengenceran berpengaruh terhadap jumlah mikroba, dimana jika tingkat pengenceran tinggi maka mikroba yang ditumbuhkan semakin sedikit begitupun sebaliknya jika tingkat pengenceran kecil maka semakin banyak mikroba yang akan tumbuh. Proses inkubasi merupakan proses dimana mikroba  tumbuh dan berkembang sesuai dengan suhu dan nutrisi yang mikroba butuhkan. Ketelitian praktikan saat menghitung jumlah mikroba pada cawan petri juga menjadi faktor, dimana praktikan yang kurang teliti saat menghitung maka akan memperoleh jumlah mikroba yang tidak sesuai.

ISOLASI MIKROBA

          

          Mikroorganisme yang hidup dan tumbuh dialam bebas memiliki  beragam jenis bentuk, ukuran,  sifat, dan karakter morfologinya. Salah satu sifat dari mikroorganisme yaitu bersifat patogen dan non patogen. Sifat  pertumbuhan dari masing-masing jenis mikroorganisme tentunya berbeda, dan tidak hanya hidup sendiri melainkan hidup secara berkoloni baik itu dari spesies yang sama maupun dari dari spesies yang berbeda, maka untuk mengetahui jenis mikroba dilakukan pemisahan mikroorganisme satu dengan yang lainnya, sehingga didapat

kan kultur murni. Kultur murni dari mikroba tersebut akan dimanfaatkan pada bidang teknologi berupa pengolahan produk pangan dan pembuatan obat-obatan.

Isolasi Mikroba
      Isolasi merupakan suatu teknik atau metode pemisahan dan pemindahan mikroba dari suatu media ke media baru. Proses isolasi  digunakan untuk memperoleh biakan murni atau kultur murni dari suatu  media yang di dalamnya terdapat berbagai macam jenis mikroba dan untuk menumbuhkan mikroba tunggal dalam satu medium. Isolasi dapat berlangsung dengan tepat jika dilakukan secara bertahap dengan menggunakan media yang tepat sesuai dengan kebutuhan nutrisi mikroba yang akan diisolasi. Proses isolasi mikroba dapat dilakukan pada cawan petri, agar tegak, dan agar miring.

Metode Isolasi Mikroba

         Proses isolasi membutuhkan metode untuk memperoleh biakan murni dari isolasi mikroba. Metode isolasi meliputi metode cawan gores (streak plate), cawan tuang (pour plate), sebar (spread plate). Metode cawan gores terdiri atas beberapa teknik meliputi  teknik goresan T, goresan radian, goresan kuadran, goresan persegi, dan goresan langsung (zig zag) yang dapat menghemat bahan dan waktu. Metode cawan tuang terdiri atas agar miring dan agar tegak. Metode yang digunakan pada praktikum ini meliputi metode cawan gores radian dan kuadran, serta metode cawan tuang agar miring dan agar tegak. 

Faktor – faktor yang Mempengaruhi Isolasi Mikroba

    Keberhasilan praktikum isolasi mikroba dipengaruhi oleh beberapa faktor meliputi sifat setiap jenis mikroba yang akan diisolasi, tempat hidup atau asal mikroba tersebut, medium pertumbuhan yang sesuai, metode isolasi yang digunakan, prosesinkubasi mikroba, dan proses inokulasi mikroba. Medium pertumbuhan yang sesuai dapat dipengaruhi oleh suhu, kelembapan relatif, cahaya, radiasi, dan pH. Faktor-faktor yang mempengaruhi praktikum isolasi mikroba meliputi medium pertumbuhan mikroba dan proses inkubasi. Mikroba yang telah tumbuh pada media asal akan menyesuaikan dengan media baru yang ditempati, sehingga jika media tersebut tidak sesuai dengan kebutuhan mikroba untuk tumbuh maka pertumbuhan mikroba akan terhambat. Proses inkubasi berperan penting dalam meremajakan mikroba yang tumbuh pada media dengan pemberian nutrient dan suhu yang terkontrol, sehingga jika suhu dan nutrient tidak sesuai dengan kebutuhan mikroba, maka mikroba tidak akan tumbuh.

Agar Miring dan Agar Tegak

           

           Agar Miring merupakan salah satu media pertumbuhan mikroba pada tabung reaksi, dimana pada saat didinginkan tabung reaksi diletakkan dengan posisi miring hingga media mengeras. Pada proses isolasi dengan agar miring, digunakan ose bundar saat melakukan penggoresan agar memudahkan  kulturisasi mikroba. Kelebihan agar miring yaitu luas permukaannya kecil sehingga peluang mikroba untuk terkontaminasi rendah Sedangkan kelemahannya yaitu hanya memuat sedikit mikroorganisme. Agar tegak merupakan salah satu media pertumbuhan mikroba pada tabung reaksi, dimana pada saat didinginkan tabung reaksi  diletakkan dengan posisi tegak. Agar tegak digunakan untuk merangsang pertumbuhan mikroba dalam keadaan kekurangan oksigen. Pada proses isolasi dengan agar tegak  digunakan ose  saat melakukan penusukan. 

Ose Tusuk dan Ose Bundar

      Ose merupakan salah satu alat yang digunakan pada proses isolasi yang berfungsi untuk memindahkan atau mengambil koloni mikroba dari suatu media ke media baru yang akan digunakan kembali. Ose terbagi atas dua jenis meliputi ose jarum dan ose bundar. Ose jarum memiliki ujung yang berbentuk jarum disebut dengan inoculating needle untuk mengisolasi secara tusukan pada agar tegak. Ose bundar memiliki ujung yang berbentuk bulat disebut dengan inoculating loop yang berguna untuk melakukan streak, baik pada cawan petri maupun agar miring.

IDENTIFIKASI MIKROBA METODE PEWARNAAN GRAM

Kenapa mikroba harus diidentifikasi ???

Mikroba merupakan makhluk hidup mikro yang mempunyai struktur morfologi dan sifat – sifat yang khas. Mikroba  berukuran sangat kecil dan tipis sehingga sukar dilihat struktur tubuhnya walaupun dengan bantuan mikroskop. Untuk melihat morfologi mikroba secara lebih jelas dikembangkan metode pewarnaan gram. 

Pewarnaan gram itu apa sih ??

Pewarnaan gram merupakan salah satu metode yang paling banyak digunakan untuk mengidentifikasi mikroba meliputi sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel.  Prinsip pewarnaan gram adalah pertukaran antara ion zat warna dengan ion protoplasma sel. Metode pewarnaan gram meliputi pewarnaan sedehana atau tunggal, dengan menggunakan satu macam zat warna dan pewarnaan diferensial dengan menggunakan dua atau lebih zat warna. Metode pewarnaan gram juga dapat membedakan spesies bakteri menjadi duagolongan yaitu bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet, sehingga pada pengamatan dibawah mikroskop sel bakteri akan tampak berwarna ungu. Sedangkan bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, sehingga pada saat diberi pewarna tandingan yaitu safranin maka pada pengamatan dibawah mikroskop sel bakteri akan tampak berwarna merah. 

Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna primer atau kristal violetpada saat pewarnaan gram, dimana bakteri gram negatif tidak akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, melainkan mempertahankan zat warna dari safranin. Sehingga jika diamati dibawah mikroskop akan berwarna merah muda.  Bakterigram negatif memiliki kandungan lipid yang tereksitasi atau keluar dari dinding sel dan pori-pori mengembang sehingga Kristal violet keluar dari sel dan sel menjadi tidak berwarna.

Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna primer atau kristal violet saat proses pewarnaan gram, dimana bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop. Bakteri Gram positif akan mempertahankan warna ungu Kristal violet karena mengandung lebih banyak peptidoglikan. Dimana bakteri gram positif akan mengalami dehidrasi pada dinding sel dan pori-porinya menciut karena daya rembes dinding sel dan membrane menurun sehingga Kristal violet tidak dapat keluar dari sel dan sel tetap berwarna ungu. 

Proses Pewarnaan Gram

     Prosedur yang dilakukan pada proses identifikasi mikroba metode pewarnaan gram yaitu terlebih dahulu masing – masing tabung reaksi diisi bahan meliputi kristal violet, iodin, alkohol, aquades, dan safranin. Setelah itu bunsen dipasang padatabung gas dan dinyalakan dengan api sedang. Kemudian kaca preparat difiksasi dan didinginkan. Kemudian bakteri Lactobacillus casei diambil secukupnya dari media  dan digoreskan pada kaca preparat menggunakan ose bundar. Setelah itu kaca preparat kembali difiksasi dan didinginkan. Kemudian koloni mikroba yang ada dipermukaan kaca preparat ditetesikristal violet  2-3 tetes dan dibiarkan ± 30 detik.Setelah itu, dibilas dengan aquades dan difiksasi didinginkan.Lalu ditetesi  iodin dan dibiarkan ± 30 detik. Kemudian dibilas kembali dengan aquades dan difiksasi, lalu diberikan alkohol dan dibilas kembali dengan aquades serta difiksasi. Setelah itu, diberi safranin dan selama beberapa detik kemudian dibilas kembali dengan aquades dan difiksasi.Setelah itu, ditutup dengan objek glass diatas permukaan preparat. Kemudian preparat dipasang dibawah mikroskop. Setelah itu, pengamatan dengan perbesaran 100X hingga diperoleh titik fokus yang sesuai. Kemudian preparat diamati dan digolongkan kedalam bakteri gram positif atau gram negatif.